Therapi genynnol ar gyfer EBS ac RDEB (2022)

Er gwaethaf anhawster cael samplau croen yn ystod cyfnod cyfyngiadau Covid, dangosodd ymchwilwyr y gallai eu triniaeth ganiatáu i'r newid genetig sy'n achosi i RDEB gael ei golli ('sgipio exon') mewn croen yn ogystal ag mewn celloedd mewn dysgl. Arweiniodd chwistrellu'r driniaeth i samplau croen a oedd yn weddill o weithdrefnau llawfeddygol at lefel isel ond canfyddadwy o exon yn neidio yn y cam cyn i'r protein colagen gael ei wneud. Mae'r ymchwilwyr yn awgrymu y byddai angen gwaith pellach i ddangos a oedd hyn yn caniatáu digon o brotein colagen sy'n gweithio i gael ei wneud i leihau symptomau RDEB.

Mae defnyddio darnau bach o asid niwclëig (fel DNA) i helpu i wneud protein colagen a keratin gweithredol o enynnau RDEB neu EBS wedi'u torri wedi dangos rhywfaint o addewid mewn celloedd. Mae wedi bod yn anoddach dangos yr effeithiau ar groen lle mae'n ymddangos bod y darnau bach hyn o asid niwclëig therapiwtig yn gweithio'n wahanol. Cyhoeddodd ymchwilwyr a adolygu o’r cynnydd yn y maes hwn yn 2021. 

Mae’r prosiect hwn wedi adeiladu ar waith yr ymchwilwyr a gyhoeddwyd yn 2019:

• Mae Sgipio Exon Naturiol yn Gosod y Cam ar gyfer Sgipio Exon fel Therapi ar gyfer epidermolysis dystroffig bullosa: Therapi Moleciwlaidd - Asidau Niwcleig (cell.com)
• Therapïau ar gyfer epidermolysis bullosa: mae cyflawni yn allweddol - Bremer - 2019 - British Journal of Dermatology - Llyfrgell Ar-lein Wiley

Prifysgol Dundee Adroddwyd ar y prosiect yn 2019.

Ymchwilwyr arweiniol:

Dr Robyn Hickerson yn Brif Ymchwilydd yn yr Ysgol Gwyddorau Bywyd gyda grŵp ymchwil gweithredol sy'n canolbwyntio'n bennaf ar ddatblygu therapiwteg ar gyfer anhwylderau croen genetig prin.
Dr Peter van den AkkerMae , Cymrawd Ymchwil Clinigol DEBRA, yn enetegydd clinigol profiadol ac mae wedi canolbwyntio ei yrfa ymchwil ar therapïau sy'n seiliedig ar RNA ar gyfer RDEB a genodermatoses eraill.

Cyd-ymchwilydd:

Dr Aileen Sandilands â phrofiad helaeth o 19 mlynedd yn y grŵp mewn anhwylderau croen genetig a datblygu systemau sgipio exon gyda'r nod o drin anhwylderau croen genetig

“Ein nod yn y pen draw yw datblygu therapiwteg ar gyfer pob math o EB… Gan adeiladu ar y canlyniadau cyffrous a chalonogol o’n gwaith blaenorol, rydym nawr yn bwriadu gwneud y gorau o effeithlonrwydd sgipio exon yn ein modelau croen dynol ex vivo ac in vivo, er mwyn dod â ni’n agosach. i dreial clinigol”

Dr Robyn Hickerson a Dr Peter Van den Akker

Teitl y Grant: Datblygu Technoleg Genynnau Newydd ar gyfer Trin epidermolysis bullosa simplex (EBS) ac epidermolysis bullosa dystroffig enciliol (RDEB)

Mae tua 70% o achosion epidermolysis bullosa (EB) yn cael eu dosbarthu fel EB simplex (EBS), a achosir gan fwtaniadau (camgymeriadau) yn y genynnau sy'n cynhyrchu proteinau o'r enw ceratin 5 a keratin 14 (KRT5 a KRT14). Mae ceratinau yn hanfodol i sicrhau croen cryf ac iach. Nid oes unrhyw driniaethau effeithiol ar gyfer EBS, a nodweddir gan bothellu parhaus ac iachâd gwael y croen yn fewnol ac yn allanol. Etifeddir genynnau, un copi gan bob rhiant. Dim ond un copi o'r genyn sydd angen cynnwys mwtaniad i achosi EBS - gelwir y rhain yn genynnau trech. Trwy atal mynegiant y copi diffygiol o'r genyn yn ddetholus, mae hyn yn caniatáu i'r copi arferol o'r genyn weithio'n iawn, a chredir y gellid datblygu strategaeth yn therapi priodol ar gyfer EBS.
Nod cychwynnol y prosiect hwn oedd datblygu technoleg newydd ar gyfer tawelu genynnau therapiwtig yn EBS. Pan fydd dilyniant genetig neu DNA genyn yn cael ei ddarllen, yn debyg i rysáit, mae'n cael ei drosi yn y pen draw trwy gam canolradd (RNA negesydd) i gynhyrchu protein - yn yr achos hwn y keratins a geir yn haen uchaf y croen, y epidermis. Mae datblygiadau newydd mewn technoleg genynnau yn golygu ei bod bellach yn bosibl syntheseiddio darn bach o asid niwclëig a fydd yn clymu i'r RNA negesydd ac yn ei anactifadu. Gelwir hyn yn dechnoleg tawelu genynnau. Darnau bach o asid niwclëig yw oligonucleotides Antisense (ASO) y gellir eu cynllunio i rwymo copïau RNA penodol o enyn penodol i negesydd er mwyn dinistrio'r rhain.

Cafodd y Cymrawd Ymchwil Glinigol y dasg o ddatblygu'r dechnoleg distewi genynnau newydd hon i'r pwynt lle y gellid mynd ag ef i'r clinig. Mae'r tîm yn Dundee wedi bod yn gweithio gyda'r cwmni fferyllol WAVE Gwyddorau Bywyd ar y prosiect hwn ac wedi nodi nifer o ASOs a all dawelu RNA negesydd KRT14 mewn celloedd croen dynol a dyfir yn y labordy.

Mae defnyddio ASOs ar gyfer epidermolysis dystroffig enciliol bullosa (math mwy difrifol o EB) yr un mor heriol. Mae epidermolysis bullosa dystroffig enciliol (RDEB) yn cael ei achosi gan namau yn y genyn COL7A1, y rysáit genetig ar gyfer y math colagen protein 7. Mae pawb yn cario dau gopi COL7A1, ond, yn wahanol i EBS, mae angen treiglad ar y ddau gopi o'r genyn i arddangos symptomau RDEB - genynnau enciliol yw'r rhain. Ni fydd y dull o ddinistrio'r RNA negesydd diffygiol yn gweithio yma. Fodd bynnag, gellir defnyddio dosbarth gwahanol o ASOs a all dwyllo'r celloedd i dynnu'r rhan o'r RNA negeseuol lle mae'r treiglad wedi'i leoli. Gelwir y dull hwn yn 'sgipio exon' ac er y bydd hyn yn arwain at RNA negesydd ychydig yn fyrrach, gellir ei ddefnyddio o hyd i gynhyrchu colagen math 7 gweithredol (ond byrrach). Mewn astudiaeth lenyddol, canfu'r Cymrawd fod pobl y mae sgipio exon yn digwydd yn naturiol ynddynt (heb ddefnyddio ASOs ond yn hytrach oherwydd amrywiad DNA ychwanegol) yn dal i fod â ffurf o DEB, ond mae hyn yn ysgafnach nag arfer. Mae hyn yn pwysleisio bod sgipio exon yn strategaeth therapiwtig addawol. Mae'r tîm yn Dundee wedi cynllunio nifer o ASOs a all gymell econon yn hepgor COL7A1 mewn celloedd croen dynol a dyfir yn y labordy.

Technoleg antisense newydd ar gyfer EB – optimeiddio sgipio exon mewn croen dynol (Cymrodoriaeth Ymchwil Clinigol Blwyddyn 5).

Mae cleifion ag anhwylder croen genetig epidermolysis bullosa dystroffig enciliol (RDEB) yn dioddef o groen hynod fregus oherwydd bod protein allweddol (colagen 7) sy'n dal haenau'r croen gyda'i gilydd ar goll. Mewn cleifion â RDEB, mae camgymeriadau sillafu (“treigladau”) yn y genyn sy'n codio ar gyfer y protein colagen 7 yn atal y corff rhag ei ​​wneud. Ym Mhrifysgol Dundee, rydym yn ceisio osgoi'r camgymeriadau sillafu yn y genyn ar gyfer colagen 7 trwy dargedu'r cam sy'n digwydd cyn i'r protein gael ei wneud. Cyn gwneud protein colagen 7, mae'r genyn yn gwneud copi cludadwy ohono'i hun yn gyntaf, gelwir y copi hwn yn RNA negesydd ac fe'i defnyddir fel templed ar gyfer gwneud y protein. Mewn cleifion RDEB, mae'r copi RNA negesydd yn cynnwys yr un camgymeriadau sillafu â'r genyn colagen 7. Ein strategaeth yw cael gwared ar ran fach o'r RNA negesydd sy'n cynnwys y camgymeriadau sillafu. Cyfeirir at y dull hwn fel “sgipio exon”. Er y bydd yr RNA negeseuol ychydig yn fyrrach nag arfer gellir ei ddefnyddio o hyd i wneud y protein colagen 7. Wrth gwrs, bydd y protein hwn hefyd ychydig yn fyrrach na'r arfer, ond mae hyn yn dal yn well na chael protein colagen 7 o gwbl.
Mae sgipio Exon yn defnyddio moleciwlau bach o'r enw Antisense oligonucleotides (ASO) sy'n glynu at gopi RNA negesydd o'r genyn colagen 7 ac yn twyllo'r celloedd i gael gwared ar y rhan lle mae'r camgymeriadau sillafu wedi'u lleoli. Rydym wedi cynllunio nifer o ASOs ac wedi dangos eu bod yn weithredol yn sgipio exon pan gânt eu hychwanegu at gelloedd croen dynol a dyfir yn y labordy. Rydym hefyd wedi gallu dangos bod yr ASOs yn weithredol mewn croen dynol go iawn (croen gwastraff llawfeddygol). Fodd bynnag, mae faint o sgipio exon y gallwn ei ganfod mewn croen yn isel ac mae'n ymddangos bod yr ASOs yn gweithio ychydig yn wahanol mewn croen o gymharu â chelloedd a dyfir yn y labordy.
Dros y flwyddyn ddiwethaf rydym wedi bod yn optimeiddio dull sy'n ein galluogi i olrhain y ffordd y mae ASO yn cael ei ddosbarthu pan gaiff ei chwistrellu i groen dynol. Roedd y dull hwn yn ein dysgu bod ASO a chwistrellwyd mewn croen dynol yn wir yn teithio o'r dermis (haen ddofn y croen lle cafodd yr ASO ei chwistrellu), i'r celloedd yn yr epidermis (haen uchaf y croen), lle mae exon yn sgipio. angen digwydd. Fe wnaeth y canlyniad hwn ein hargyhoeddi ymhellach y gall triniaeth ASO yn wir achosi sgipio exon mewn croen dynol go iawn. Unwaith eto, roedd hwn yn ganlyniad calonogol. Fodd bynnag, roedd faint o sgipio exon a welsom mewn croen yn isel ac mae'n ymddangos bod yr ASOs yn gweithio ychydig yn wahanol ar y croen o'u cymharu â chelloedd a dyfwyd yn y labordy. Felly, rydym bellach yn canolbwyntio ar wneud sgipio exon yn y croen yn fwy effeithlon.
Y llynedd rydym hefyd wedi dylunio a phrofi 37 o ASOs newydd yn erbyn exon 13 mewn celloedd croen i weld a allwn nodi ASO sy'n gweithio hyd yn oed yn well na'r rhai yr ydym yn eu defnyddio ar hyn o bryd. Rydym hefyd wedi cynllunio 33 o ASOs newydd yn erbyn exon 15 i'w profi yn yr un modd. Mae canlyniadau rhagarweiniol wedi nodi nifer o ASOs sy'n dangos gweithgaredd sgipio exon 13 ac felly bydd y rhain yn cael eu hymchwilio ymhellach. (O adroddiad cynnydd 2022.)

Technoleg antisense newydd ar gyfer EB - hyrwyddo sgipio exon mewn croen dynol (Blynyddoedd 3-4).

Y prif nod yn awr yw astudio a all yr ASOs swyddogaethol gymell yr exon i hepgor y genyn COL7A1 a distewi'r copi RNA mutant KRT14 pan gaiff ei roi ar groen dynol (gan ddefnyddio croen dros ben o weithdrefnau llawfeddygol). Mae hyn yn cynnwys astudio ffyrdd o gyflwyno'r ASOs hyn i'r lleoliad cywir yn y croen. Felly, mae'r Cymrawd yn gweithio'n agos gyda thîm Dr Hickerson.
Prif nodau’r gymrodoriaeth ymchwil glinigol wrth symud ymlaen yw:
• Ysgogi'r mRNA mutant KRT14 i drin EBS (i weithio ar ddileu'r RNA negesydd ceratin sy'n cario'r treiglad).
• Hepgor ecsonau sy'n cynnwys treigladau yn y genyn COL7A1 i drin RDEB (i dwyllo celloedd y corff i dynnu neu beidio â darllen y rhan o'r genyn lle mae'r mwtaniad wedi'i leoli).

Mae cleifion ag anhwylder croen genetig epidermolysis bullosa dystroffig enciliol (RDEB) yn dioddef o groen hynod fregus oherwydd bod protein allweddol (colagen 7) sy'n dal haenau'r croen gyda'i gilydd ar goll. Mewn cleifion â RDEB, mae camgymeriadau sillafu (“treigladau”) yn y genyn sy'n codio ar gyfer y protein colagen 7 yn atal y corff rhag ei ​​wneud.

Yn ystod y prosiect hwn rydym wedi bod yn ceisio twyllo celloedd i osgoi'r camgymeriadau sillafu yn y genyn ar gyfer colagen 7. I wneud hyn fe wnaethom dargedu cam pwysig sy'n digwydd cyn i brotein gael ei wneud. Mae'n rhaid i enyn wneud copi cludadwy ohono'i hun yn gyntaf, gelwir y copi hwn yn negesydd RNA ac fe'i defnyddir gan y celloedd fel templed ar gyfer gwneud y protein. Mewn cleifion RDEB, mae'r copi RNA negesydd yn cynnwys yr un camgymeriadau sillafu â'r genyn colagen 7. Ein strategaeth yw golygu'r rhan fach o'r RNA negesydd sy'n cynnwys y camgymeriad sillafu. Rydym yn galw’r dull hwn yn “sgipio exon”. Trwy olygu'r RNA negesydd yn y modd hwn a chael gwared ar y camgymeriad sillafu gall y celloedd nawr wneud y protein colagen 7. Wrth gwrs, bydd y protein hwn ychydig yn fyrrach na'r arfer, ond mae hyn yn dal yn well na chael unrhyw brotein colagen 7 o gwbl.

Mae sgipio Exon yn defnyddio moleciwlau bach o'r enw antisense oligonucleotides (ASO), mae'r rhain yn glynu at gopi RNA negesydd o'r genyn colagen 7 ac yn twyllo'r celloedd i dynnu'r rhan sy'n cynnwys y camgymeriad sillafu. Rydym wedi dylunio sawl GCA ac wedi dangos eu bod yn gallu achosi sgipio exon pan fyddwn yn trin celloedd croen dynol a dyfir yn y labordy. Rydym hefyd wedi ceisio trin celloedd croen claf RDEB gyda'n ASOs ac mae'n ymddangos eu bod yn gweithio yn yr un ffordd. Gallwn hefyd ganfod protein colagen 7 yn y celloedd hyn ar ôl ei drin gyda'r ASOs, sy'n dweud wrthym fod yr ASOs yn gweithio yn ôl y bwriad.

Mae swm sylweddol o'r prosiect wedi'i wario i ganfod a yw'r ASOs yn gweithio gyda chroen dynol. Ein nod yn y pen draw yw defnyddio'r ASOs i drin cleifion felly mae'n bwysig gwybod a ydyn nhw'n actif yn y croen yn hytrach na dim ond mewn celloedd mewn dysgl. Cyn i ni allu dechrau ar y gwaith hwn, roedd yn rhaid i ni ddatblygu dulliau canfod hynod sensitif i godi sgipio exon oherwydd nad oedd yr offer ymchwil hyn yn bodoli'n fasnachol. Ar gyfer yr arbrofion croen fe wnaethom chwistrellu'r ASOs i groen iach dros ben o weithdrefnau llawfeddygol ac yna dadansoddi'r croen ar gyfer sgipio exon. Canfuom y gall ASOs achosi sgipio exon mewn croen dynol sydd wrth gwrs yn ganlyniad hynod galonogol. Fodd bynnag, yr her fawr sy'n ein hwynebu yw bod nifer y sgipio exon y gallwn ei ganfod yn y croen yn isel. Mae'n ymddangos bod yr ASOs hefyd yn gweithio ychydig yn wahanol mewn croen o gymharu â chelloedd a dyfir yn y labordy. Rhaid cyfaddef nad ydym yn gwybod a yw lefel y sgipio exon a welwn yn y croen yn ddigon i fod o fudd i gleifion (dim ond treial clinigol fyddai’n rhoi ateb pendant) ond teimlwn fod lle i wella o hyd. Felly, yn rhan olaf y prosiect buom yn canolbwyntio ar ffyrdd o gynyddu faint o sgipio exon yn y croen. Fe wnaethon ni ddylunio set newydd o ASOs i geisio nodi un sy'n gweithio hyd yn oed yn well na'r rhai rydyn ni'n eu defnyddio ar hyn o bryd, ac fe wnaethon ni hefyd geisio cymysgu'r ASOs ag adweithydd sydd wedi'i gynllunio i wneud y defnydd o'r ASOs i mewn i'r celloedd yn haws ar ôl iddynt gael eu chwistrellu i mewn. y croen.

Yn gyffredinol, mae'r prosiect hwn wedi dangos ei bod yn bosibl defnyddio ASOs i gymell sgipio exon mewn croen dynol go iawn. Bydd angen optimeiddio'r ASOs a gwelliannau yn y ffordd y cânt eu cyflwyno i'r croen i gryfhau eu heffeithiau. Os gellir goresgyn y rhwystrau hyn, mae sgipio exon fel triniaeth ar gyfer RDEB yn parhau i fod yn opsiwn ymarferol. (O adroddiad terfynol 2022.)