Therapi genynnol parhaol ar gyfer DEB

Mae cam cyntaf y broses o fewnosod genyn gweithredol wedi'i gyflawni mewn celloedd 'hawdd eu defnyddio' yn y labordy. Mae ymchwilwyr bellach yn gweithio ar ffordd ddiogel ac effeithiol o wneud hyn yng nghelloedd croen cleifion. Mae ymchwilwyr wedi bod yn defnyddio nanoronynnau i gario'r genyn sy'n gweithio i gelloedd mewn dysgl ac maent bellach yn eu profi ar groen model.

Mae canlyniadau wedi'u cyhoeddi yn 2024 yn y British Journal of Dermatology ac yn y Cyfnodolyn Dermatoleg Ymchwiliol.

Cyflwynodd Dr Jacków ddiweddariad ar y prosiect ym Mhenwythnos yr Aelodau 2024:

Prif ymchwilydd:

Mae gan Dr Joanna Jacków brofiad helaeth a hanes profedig mewn therapi genynnau epidermolysis bullosa a chymwysiadau golygu genynnau. Mae Dr Jacków wedi arddangos golygu genynnau effeithlon gan ddefnyddio amrywiaeth o offer golygu genynnau, gan gynnwys CRISPR-Cas9, golygu sylfaenol a chysefin, mewn DEB i atgyweirio mwtaniadau mewn ceratinocytes, ffibroblastau a bôn-gelloedd lluosog anwythadwy (iPSCs).

Cyd-ymchwilwyr:

Mae'r Athro John McGrath wedi datblygu therapïau celloedd DEB datblygedig yn seiliedig ar chwistrellu ffibroblastau wedi'u cywiro COL7A1, gan ddangos diogelwch ac effeithiolrwydd cynnar mewn treialon clinigol. Bydd yn canolbwyntio ar ddethol a nodweddu samplau celloedd a bydd yn helpu i greu piblinell ar gyfer cyfieithu clinigol cyflym o therapïau genynnau COL7A1 newydd mewn cleifion.

Mae gan yr Athro Stephen Hart (UCL, GOSH, Llundain) brofiad helaeth mewn fformwleiddiadau cyflwyno newydd a dulliau o asidau niwclëig therapiwtig gyda nanoronynnau anfeirysol a'u cymhwyso i drin clefydau gan gynnwys ffibrosis systig, niwroblastoma, dyskinesia ciliaraidd sylfaenol, a naevi melanocytig cynhenid .

“Wrth wrando ar bobl gyda DEB, rydyn ni’n gwybod bod y freuddwyd o “hufen genyn” yn uchel ar restr dymuniadau pawb… Mae ein prosiect ymchwil newydd yn ymwneud â datblygu ffurf barhaol o therapi genynnau COL7A1 amserol. Ar hyn o bryd, rydym am ddatblygu technoleg newydd i fewnosod copi cyflawn o’r genyn COL7A1 yn ddiogel yn genom rhywun â DEB.”

– Dr Joanna Jacków

Teitl grant: PASTE-Mediated Superexon Amnewid COL7A1 fel Triniaeth ar gyfer Epidermolysis Dystroffig Bullosa

Dros y 30 mlynedd diwethaf rydym wedi dysgu bod DEB yn cael ei achosi gan amrywiadau DNA yn y genyn colagen math VII (COL7A1). Heb genyn COL7A1 swyddogaethol, ni all y croen wneud digon o brotein colagen math VII sy'n golygu bod y croen yn llai gwydn i anaf a phothelli'n datblygu. Yr her i ymchwilwyr fu sut i ailosod neu drwsio'r genyn COL7A1. Wrth wrando ar bobl gyda DEB, rydyn ni’n gwybod bod y freuddwyd o “eli genyn” yn uchel ar restr dymuniadau pawb.

Rydym hefyd wedi'n cyffroi gan gynnydd diweddar wrth ddatblygu cynnyrch genynnau COL7A1 amserol newydd gan gydweithwyr ym Mhrifysgol Stanford mewn partneriaeth â Krystal Biotech, er bod angen i'r dull hwnnw gael ei gymhwyso dro ar ôl tro i gael effaith hirdymor. Mae ein prosiect ymchwil newydd yn ymwneud â datblygu ffurf barhaol o therapi genynnau COL7A1 amserol. Ar y cam hwn, rydym am ddatblygu technoleg newydd i fewnosod yn barhaol gopi cyflawn o'r genyn COL7A1 yn ddiogel i genom rhywun â DEB. Enw’r system therapi genynnau newydd yw PASTE, sy’n golygu “Ychwanegiad Rhaglenadwy trwy Elfennau Targedu Safle-benodol”. Ar gyfer y prosiect hwn, byddwn yn defnyddio PASTE i fewnosod y genyn COL7A1 i mewn i gelloedd croen DEB. Yna byddwn yn gwirio i weld a allwn adfer y math VII colagen. Yna byddwn yn gweithio ar optimeiddio systemau dosbarthu lipid i wneud yn siŵr y gallwn gael y therapi i mewn i groen ac nid celloedd yn unig. Am y tro, nid ydym yn cynnal treial clinigol, ond dyna fydd ein cynllun nesaf.

Mae'r prosiect hwn yn canolbwyntio ar ddatblygu bwriad i wella triniaeth ar gyfer epidermolysis bullosa dystroffig (DEB). Mae cynnydd sylweddol wedi'i wneud wrth ddatblygu therapi genynnau amserol ar gyfer DEB gan ddefnyddio fectorau firaol nad ydynt yn integreiddio i gyflenwi COL7A1 i groen clwyfedig er bod angen ei roi dro ar ôl tro er budd parhaus.

Fel dull gweithredu pellach, ein nod yw defnyddio integreiddiad parhaol o enyn COL7A1 hyd llawn gan ddefnyddio adio rhaglenadwy trwy elfennau targedu safle-benodol (PASTE). Mae PASTE yn cyfuno penodoldeb a diogelwch golygu cysefin â chapasiti cario mawr integrasau serine i gyflwyno hyd at 36kb o ddeunydd ar safleoedd wedi'u peiriannu'n benodol yn y genom. Bydd integreiddio genyn COL7A1 hyd llawn yn barhaol yn caniatáu dull golygu DNA “un maint i bawb”.

Yn gyntaf, byddwn yn dewis ac yn nodweddu keratinocytes a / neu ffibroblastau o groen claf DEB. Yna byddwn yn dilysu dyluniad lluniad PASTE gan ddefnyddio electroporation o plasmidau wedi'u teilwra. Bydd integreiddio genynnau COL7A1 yn cael ei gadarnhau gan ddefnyddio dilyniannu PCR- a Sanger. Bydd celloedd a olygwyd yn llwyddiannus yn cael eu hynysu a'u hail-nodweddu i archwilio achub colagen math VII. Ar ôl dilysu'r dyluniad adeiladu, yn lle DNA plasmid, bydd ensymau PASTE yn cael eu danfon trwy mRNA electroporated in-vitro wedi'i syntheseiddio. Nesaf, byddwn yn canolbwyntio ar ddulliau dosbarthu, gan ddatblygu nanoronynnau seiliedig ar lipid (LNPs) wedi'u targedu gan dderbynyddion i gyflenwi peiriannau PASTE i dargedu celloedd. Bydd arddangosfa Phage yn nodi dilyniannau peptid sy'n rhwymo'n gryf ac yn ffafriol i ffibroblastau a keratinocytes. Bydd cydrannau lipid yn cael eu harchwilio i weld a ydynt yn addas ar gyfer defnydd amserol mewn modelau croen 3D. Yn gryno, nod y prosiect hwn yw datblygu math newydd o therapi amnewid genynnau ar gyfer DEB.

Mae gan ein prosiect ddau brif nod:

Yn gyntaf, rydym am gymryd copi cyfan o enyn heb ei dreiglo a'i fewnosod yn DNA cleifion fel y gall eu celloedd ddechrau gwneud y protein sydd ei angen ar gyfer croen iach. Bydd hyn yn ein galluogi i greu genoteip-agnostig (hy mae'n gweithio ni waeth pa dreiglad sydd gan glaf) a gwellhad parhaol. Yn ystod y chwe mis diwethaf, rydym wedi sicrhau bod cam cyntaf y golygu DNA yn gweithio'n dda iawn mewn celloedd hawdd eu newid, ond mae celloedd croen cleifion yn profi'n fwy ystyfnig. Rydyn ni nawr yn gweithio ar sicrhau bod gennym ni brotocol diogel ac effeithiol i newid DNA yn y celloedd sy'n bwysig.

Yn ail, rydym am greu nanoronynnau a all gario'r peirianwaith golygu DNA hwn i mewn i gelloedd croen gyda fformiwla hufen amserol hawdd ei roi. Rydym yn arbrofi gyda gwahanol fformiwlâu ar gyfer y nanoronynnau hyn. Rydym wedi cyflawni rhai canlyniadau addawol wrth roi nanoronynnau ar gelloedd mewn dysgl, ac yn awr rydym yn eu profi ar groen model. Bydd hyn yn anoddach (mae croen wedi esblygu'n benodol i gadw pethau allan), ond mewn cleifion EB, mae'r rhwystr croen eisoes wedi'i wanhau a'i amharu. Rydym yn archwilio ffyrdd o rag-drin y croen model i efelychu croen cleifion EB, a gobeithio y bydd hynny'n caniatáu i'r nanoronynnau dreiddio'n ddyfnach i'r meinwe. (O adroddiad cynnydd 2025.)